二、流式細(xì)胞術(shù)的基本操作與技巧

1）細(xì)胞的制備、培養(yǎng)

2）封閉

3）熒光素偶聯(lián)抗體標(biāo)記

4）光電倍增管電壓的設(shè)定

5）對(duì)照的設(shè)置

6）補(bǔ)償調(diào)節(jié)

以體外培養(yǎng)的PBMC細(xì)胞為例：

1、細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，直接收集細(xì)胞于1.5ml的EP管中，350g，4°C離心5min，棄上清；

2、然后用1ml FACS buffer重懸沉淀，350g，4°C離心5min，棄上清；

3、封閉：標(biāo)記樣品細(xì)胞的熒光素偶聯(lián)抗體多為單克隆抗體，少數(shù)也可能是多克隆抗體，其基本結(jié)構(gòu)都由兩部分組成，即包含有特異性結(jié)合抗原位點(diǎn)的Fab段和相對(duì)保守的Fc段，抗體的特異性表現(xiàn)在Fab段，標(biāo)記時(shí)利用Fab段的抗原結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞上抗原分子特異性結(jié)合，從而標(biāo)記并且相對(duì)量化細(xì)胞表達(dá)該抗原分子的情況。但是，有些細(xì)胞表面表達(dá)FcR(Fc receptor, Fc受體），如巨噬細(xì)胞、DC、B淋巴細(xì)胞等， FcR可以與熒光素偶聯(lián)抗體的Fc段進(jìn)行非特異性的結(jié)合，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

封閉方法1： 取適量的血清全I(xiàn)gG抗體與樣品細(xì)胞充分混勻，4'C靜置 15min。研究人的細(xì)胞時(shí)，若熒光素偶聯(lián)抗體來(lái)源于小鼠，封閉采用小鼠血清全I(xiàn)gG抗體。原則是，如果流式抗體可能與樣品細(xì)胞的FcR發(fā)生非特異性結(jié)合，那么在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體之前先用流式抗體同源的全I(xiàn)gG抗體進(jìn)行封閉，使樣品細(xì)胞表面的FcR飽和。

封閉方法2： 適量的抗CD16和抗CD32單克隆抗體與樣品細(xì)胞充分混勻，4'C靜置 15min。CD16是一種FcR, 能夠與IgG的Fc段結(jié)合，親和力較強(qiáng)；CD32也是一種 FcR, 能夠與IgG的Fc段結(jié)合，親和力中等。而熒光素偶聯(lián)抗體基本上是IgG抗體，所以在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體前可以用抗CD16和抗CD32單克隆抗體封閉樣品細(xì)胞，使樣品細(xì)胞表面的FcR都被抗CD16 或抗CD32單克隆抗體結(jié)合，從而阻止后續(xù)熒光素偶聯(lián)抗體與FcR的非特異性結(jié)合。

4、標(biāo)記相應(yīng)的熒光素偶聯(lián)抗體，這里以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC為例，一般染色體系推薦100μl，CD3、CD4表達(dá)量相對(duì)較高，1μl足夠了，假如有9個(gè)樣本，分別取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混勻后，分別取100μl加到9個(gè)樣品孔中，混勻，室溫、避光染色20min；

5、加1ml FACS buffer洗去未結(jié)合的抗體，350g，4°C離心5min，棄上清，用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重懸沉淀，盡快上機(jī)分析。

6、電壓的設(shè)定：上機(jī)分析時(shí)，確認(rèn)機(jī)器沒(méi)有問(wèn)題后，首先就是調(diào)節(jié)每個(gè)通道的光電倍增管的電壓，目的是為了區(qū)分細(xì)胞群，假如我們想研究人的淋巴細(xì)胞群，我們都知道人的PBMC含有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞還有中性粒細(xì)胞等，那我們?cè)趺窗阉鼈兎珠_呢？這時(shí)候就要用到我們前面提過(guò)的FSC和SSC，通過(guò)調(diào)節(jié)FSC和SSC的電壓，區(qū)分淋巴細(xì)胞亞群，原則就是使樣品細(xì)胞或者目標(biāo)細(xì)胞位于流式圖的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的電壓確定之后就開始調(diào)節(jié)APC-cy7、FITC的電壓（我們可以在鋪細(xì)胞的時(shí)候多鋪一個(gè)孔，染色時(shí)將CD3-APC-cy7、CD4-FITC均染上，用于FSC、SSC、APC-cy7、FITC電壓的調(diào)節(jié)），原則就是使陽(yáng)性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞群盡可能的分離。